1.“記錄”入侵者檔案

其中的“間隔序列”來(lái)源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細(xì)菌對(duì)這些外來(lái)入侵者的“記錄”。（如圖A所示）。

▲圖1 CRISPR序列示意圖

病毒或外源質(zhì)粒上，存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對(duì)應(yīng)。“原間隔序列”的選取并不是隨機(jī)的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱(chēng)為PAM（Protospacer adjacent motifs-原間隔序列臨近基序）。

當(dāng)病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識(shí)別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細(xì)菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復(fù)序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過(guò)程。

2、打擊二次入侵者

當(dāng)外源質(zhì)�；虿《驹俅稳肭炙拗骶鷷r(shí)，會(huì)誘導(dǎo)CRISPR序列的表達(dá)。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱(chēng)為Cas基因。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA和Cas基因的表達(dá)產(chǎn)物等一起合作，通過(guò)對(duì)PAM序列的識(shí)別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，來(lái)找到外源DNA上的靶序列，并對(duì)其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應(yīng)答。

正是基于細(xì)菌的這種后天免疫防御機(jī)制，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，從而使科學(xué)家們利用RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶實(shí)現(xiàn)對(duì)多種細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。

三、CRISPR/Cas9技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要什么？

在CRISPR/Cas9技術(shù)中，我們把即將被編輯的細(xì)胞基因組DNA看作病毒或外源DNA�；�因編輯的實(shí)現(xiàn)只需要兩個(gè)工具——向?qū)�RNA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

其中，向?qū)�RNA的設(shè)計(jì)并不是隨機(jī)的，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（即三堿基序列NGG，其中N可以是任意堿基），而且向?qū)�RNA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)�RNA(向?qū)�RNA1，向?qū)�RNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)�RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

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